緩沖液的作用是在一定的范圍內(nèi)緩沖調(diào)整溶液的pH值，使待測溶液的酸度符合分析方法所規(guī)定的范圍。其中，磷酸鹽緩沖液截止波長低于200nm，在較低分析波長下仍可使用，具有三個pKa值，可提供1.1~3.1，6.2~8.2，11.3~13.3三個pH緩沖范圍，是HPLC在紫外檢測條件下zui常用的緩沖液之一。

配制磷酸鹽緩沖液時，通常所說的濃度0.01M指的是緩沖溶液中所有的磷酸根濃度，而非Na⁺或K⁺的濃度，Na⁺或K⁺的作用是調(diào)節(jié)滲透壓。

各種濃度PB(pH=7.4)的配制：

先配0.2M PB（pH=7.4，100mL）：取0.2 mol/L的Na₂HPO₄母液81mL及0.2mol/L的NaH₂PO₄母液19mL，混勻。然后只需將0.2M PB（pH=7.4）按相應(yīng)比例

適當(dāng)稀釋即可，如：

0.1M PB（pH=7.4）：取500mL 0.2M PB，加水稀釋至1L。

0.01M PB（pH=7.4）：取50mL 0.2M PB，加水稀釋至1L。

0.02M PB（pH=7.4）：取100mL 0.2M PB，加水稀釋至1L。

以上配制方法可供參考。日常配制流動相時常使用緩沖鹽搭配酸/堿溶液進行pH調(diào)節(jié)。

在使用酸/堿溶液調(diào)節(jié)緩沖溶液的pH時，使用低濃度（0.1mol/L）比使用高濃度（1mol/L）引起的誤差更小，對緩沖溶液pH的重復(fù)性和分析結(jié)果的重現(xiàn)性更有優(yōu)勢，尤其是針對一些對pH敏感的分析項目。

應(yīng)用案例：

客戶反饋參考應(yīng)用報告的液相條件，同一臺液相，不同天配制的流動相，配制方式一樣，分離重現(xiàn)性不好，有時能分開，有時會重合無法分離。了解到客戶稱取磷酸鹽后溶于1L超純水中后，再滴加1mol/L堿溶液進行pH調(diào)節(jié)。此方法容易造成配制差異，引起峰分離情況差異。

優(yōu)化流動相配制方法：

① 精密稱取Mg±0.001g磷酸鹽，溶于約800mL超純水中溶解。

② 預(yù)先配制0.1mol/L氫氧化鈉/氫氧化鉀溶液，稱樣量Ng±0.001g，用量筒準(zhǔn)確量取100mL堿溶液備用。

③ 將量取的堿溶液緩慢加入已溶解的磷酸鹽溶液中，觀察pH變化，達到目標(biāo)pH后，停止加入堿溶液，記錄所需堿溶液體積。

④ 再在緩沖鹽溶液中加入超純水定容至1L。

⑤ 后續(xù)配制只需量取固定體積的堿溶液加入固定稱樣量的緩沖溶液中，即可達到固定的pH。成功減小流動相配制差異，提高峰分離重現(xiàn)性。

效果見下圖：

結(jié)論：

流動相pH的穩(wěn)定性與準(zhǔn)確性對樣品分析的影響較大時，需盡量規(guī)避流動相配制時的人員誤差，環(huán)境誤差，儀器誤差，物料稱量誤差等，以保證方法分析效果的重現(xiàn)性。